ELISA，即酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种在免疫荧光和放射免疫技术之后发展而来的先进免疫检测方法。开发成功的ELISA技术，关键在于选择和组合合适的试剂和耗材。对试剂耗材的特性以及多样性的深入理解，有助于在不同实验需求下找到合适的组合，从而开发出高质量的ELISA方法。

一、酶标板材的选择

市面上提供的酶标板材通常是聚苯乙烯（C₈H₈）的多种化学修饰款式。优质的生产厂家往往会根据高结合力（High Binding）和中结合力（Medium Binding）对其产品进行说明。然而，基于多年的工作经验，笔者更倾向于以亲水、弱亲水、未处理和疏水四种类型来分类和理解酶标板材的特性。通常情况下，酶标板材的亲水性越强，能结合的蛋白质数量就越多。例如，亲水板材可以吸附最高220ng的抗体，而疏水板材只能吸附约100ng。这种亲水到疏水的转变不仅影响蛋白质的结合效率，且可能导致非特异性结合，从而影响实验结果。为了确保高效率的ELISA实验，实验室应准备多种不同特性的酶标板材供选择。

二、包被液的使用

常用的包被液包括PBS（pH 7.4）和碳酸钠-碳酸氢钠溶液（pH 9.6）。包被的pH值和离子浓度会直接影响蛋白质的包被效率，因此必须根据蛋白质特性进行合理分析。值得注意的是，包被后并非所有的蛋白质都会吸附在酶标板材上，仍有部分留在溶液中。文献显示，采用真空抽吸来提高包被蛋白的吸附密度可能会提升吸附效果。

三、封闭剂的选择

常见的封闭剂包括3% BSA（w/v）和5%脱脂奶粉（w/v）。封闭剂的作用是覆盖酶标板材中被包被蛋白外的结合位点，以减少后续样品及酶联抗体等物质的非特异性吸附。根据经验，对于成分复杂的样品，传统封闭剂的效果可能不佳，此时选择分子量较小的封闭剂（如酪蛋白）或许能取得更好的封闭效果。特别需要注意的是，在生物素-链霉亲和素的检测体系中，应避免使用含有生物素的脱脂奶粉。

四、洗涤液和稀释液的配置

洗涤液通常选用中性缓冲液加适量去污剂，例如PBST（0.05% (V/V) Tween-20 in PBS）。在稀释液中也可添加一定浓度的封闭剂，如0.5% BSA (W/V) in PBST。在一些体内样品的检测中，建议加入一定浓度的阴性血清，以确保不同稀释级别样品的非特异性背景一致。

五、酶联抗体的种类

酶联抗体有多种类型，可以根据作用位点分为特异性酶联抗体和通用型酶联抗体。特异性酶联抗体特定于某一蛋白的表位，而通用型酶联抗体则主要针对标签或特定区域。常见的酶标记有碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化氢酶（HRP）。此外，酶联抗体还可依据分子量的大小划分为全长酶联抗体、Fab片段酶联抗体和scFv酶联抗体，分子量较小的抗体可能更加灵活，但也增加了非特异性结合的风险。

六、显色液和酶标仪的搭配

显色液的选择应与酶联抗体标记的酶相匹配，同时考虑与实验室现有酶标仪的兼容性。例如，采用HRP标记的抗体时，可使用TMB显色液进行吸光度检测，或使用Ampliflu™Red进行荧光检测，或者选择QuantaRed ADHP进行化学发光检测。一般而言，ELISA方法的灵敏度受底物检测方法的限制，化学发光底物的信号下限优于荧光底物，再优于吸光度底物。即便是常用的TMB显色液，不同供应商的显色强度也各有差异，合理选择显色液是确保实验成功的关键。

在生物医疗研发中，运用尊龙凯时品牌的高品质ELISA试剂和耗材，将进一步提升实验的可靠性和精确度，为科研工作提供有力支持。