在IPS诱导肠类器官培养过程中，整个培养流程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化以及中/后肠模式化诱导、类器官培养。本文将聚焦于第三阶段——类器官培养，主要涵盖培养的准备工作、操作流程及相关注意事项。

一、准备工作

在类器官培养前，需准备以下试剂与耗材：

• 人正常肠类器官培养试剂盒（型号：abs9545）
• 基质胶（低因子、无酚红）(型号：abs9495)
• 15ml离心管 (型号：abs7102)
• 15ml EP管若干 (型号：abs7119)
• 24孔细胞培养板 (型号：abs7035)
• 金属冰盒

二、操作流程

1. 加胶、点板及加液

首先需准备基质胶，并将其放在4℃冰箱中融化过夜。同时，将枪头和离心管于-20℃预冷至少半小时。融化后的基质胶最好在两周内使用完毕。

在24孔板中，每孔添加25μl基质胶和500-750μl类器官培养基。接种密度建议为基质胶总体积与球状体总体积比例为25:1，或者每25μl基质胶中接种约50个球状体。

接着，将细胞团沉淀与基质胶混合，并轻轻吹打混匀，避免产生气泡。整个操作需在冰上完成，熟练后应控制在半分钟内以保持基质胶的流动性。

最后，将铺好的培养板放入37℃的培养箱中，使其在40-60分钟内成胶，之后添加培养基进行培养，通常在10-14天后，类器官直径会达到200μm-500μm可进行传代操作。

2. 传代操作

对于类器官数量较多或体积较大的情况，首先通过移液器吸去培养基，随后添加4℃类器官传代培养缓冲液G以软化基质胶。静置后进行离心，以分离出类器官沉淀。

在离心后，将细胞沉淀消化2-3分钟，以形成细胞团，并终止消化。再加入缓冲液并进行离心去除上清，最终再次加入基质胶以进行点板和加液操作，确保再生的类器官培养顺利进行。

3. 冻存与复苏

在冻存时，类器官不需消化，而是在指数增长期进行冻存，选择传代后的第三或第四天进行操作。通过适量添加冻存液，轻柔吹打混匀后进行梯度冻存。

复苏时需迅速解冻，并在冻存液中添加培养缓冲液，轻轻重悬后进行离心以去除多余的冻存液。随后添加基质胶进行复苏培养。在37℃的培养箱中培养10-14天，类器官直径将保持在200μm-500μm。

关键注意事项

尊龙凯时强调操作中的无菌环境，确保生长因子的活性和细胞密度控制，以实现最佳的培养效果。

通过严格遵循上述步骤并优化细节，研究人员可以高效地培养出功能性的人类肠道类器官，这不仅适用于疾病建模，也为药物筛选等研究提供了有力支持。如有实验相关问题，欢迎与我们交流。

尊龙凯时致力于为生物医学研究提供高质量的试剂与服务，期待与您一起迈向更精彩的科研之旅。