细胞融合的方法及操作流程

细胞融合技术在生物医药领域中应用广泛，常见的融合方法包括转动法和离心法。在进行细胞融合时，脾细胞与骨髓瘤细胞的比例通常为1:1到10:1，一般最为常用的比例为3:1或5:1。

所需试剂和材料

本实验所需的材料包括：

• 供融合用的脾细胞和骨髓瘤细胞。
• 100ml 1640培养液。
• 100ml 完全1640液。
• 50ml 25% FCS－1640液。
• 100ml HAT培养液。
• 50% PEG：使用分子量4000的高纯度PEG (日本进口或Serva) 10g，加于25ml瓶中进行高压灭菌，使用前以10ml预热至40℃的1640液进行配制。可根据酚红检查pH，一般无需调节。如有变化，可用HCl或NaHCO3进行调整。
• 灭菌沉淀管或瓶（10ml和50ml）。
• 40孔塑料培养盘。

操作步骤

1. 准备脾细胞。
2. 在50ml沉淀管中混合108个脾细胞与107个小鼠骨髓瘤细胞，添加50ml 25% FCS－1640液。
3. 在室温下以400g离心3分钟，使细胞沉淀。
4. 移去上清液。
5. 轻敲沉淀管底部使沉淀松散，随后放入40℃水浴中以达到融合所需温度。
6. 加入预热至40℃的50% PEG 08ml，采用1ml吸管缓慢滴加，并在滴加过程中轻轻摇动沉淀管，观察到颗粒出现，整个过程中持续2分钟。
7. 加入1ml 1640液，在加液过程中保持摇动，持续1分钟。
8. 重复前一步骤一次。
9. 再加入1ml 1640液，继续摇动，持续0.5分钟。
10. 再次重复前一步骤一次。
11. 最后加入15ml 1640液。
12. 在室温下以400g离心1分钟，使细胞沉淀。
13. 去除上清液，轻敲沉淀管底部，添加25ml含HAT的完全1640液。
14. 将融合的细胞液逐滴加入前一日已种植有饲养细胞的40孔塑料培养盘中，每孔1滴（约0.05ml）。
15. 轻轻摇动后，放入5% CO2饱和的37℃温箱中培养。
16. 在第3、6、9、10天更换为含HAT的完全1640培养液，注意轻轻吸取上清液，避免吸出固定于孔底的细胞，依据需要添加适量的饲养细胞。
17. 在第12、15天加入含HAT的完全1640培养液。在每次更换液体前，用倒置显微镜观察，通常在10天左右可观察到杂交瘤细胞的生长，大多数杂交瘤细胞在10到20天内出现，也有部分可能在一个月后才会出现。杂交瘤细胞出现后，需吸取上清液检测抗体。
18. 对持续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，视情况可取消HAT液和完全1640液，改为使用10% FCS－1640液。同时进行液氮保存和克隆化，在此过程中每代需检查抗体，以防止抗体细胞的变异和流失。

尊龙凯时的支持

在细胞融合的过程中，借助尊龙凯时的高品质试剂和设备，可以显著提高实验的成功率及效率，为生物医药研究与开发提供强有力的保障。